• ks. clustered regularly interspaced short palindromic repeats.

    prokaryotik bagisiklik sistemi olarak calisan tekrarlayan dna dizileri kumeleri (bizlerdeki bagisiklik sistemini saglayan dna kumelerine ise suradan bakiniz: #18766716). dis etken kalitsal materyallere karsi korunma saglayan crispr, bir cesit edinilmis bagisiklik sunar. ilk olarak 1987 yilinda e coli'de tanimlanan bu sistem, cas isimli enzimleri sayesinde konak canliya yabanci dna dizilerine ozgun islem yapar. hatta virusune gore her prokaryotik turde beraber evrimlesmis dna dizileri ve cas enzim mekanizmalari oldugu dusunulmektedir.

    2012 yilinda bu mekanizmayi bir arac olarak kullanmak suretiyle yepyeni ve bir o kadar da verimli bir genetik modifikasyon metodu gelistirildi. ve iste tam bir sene icerisinde oylesine yol katedildi ki bu teknigin kullanimi adina (pmid: 22745249, 23287718, 23287722, 23643243) bilim kurgu filmlerinde olsa bu gelisme, sinkaf ettirirdi bizlere "boylesine de uydurulmaz diye".

    ozetle, sayin eksi sozluk okurlari, ben bunca senelik genetik doktoru, evet ben marietouchet bu teknoloji onunde diz cokuyorum.

    gun gelecek hepimiz crispr/cas9 kullanacagiz.
  • genetik işlerinden çok anlamayan insanlar olabilir veya okurken kafası tam olarak almayan insanlar olabilir. o yüzden youtube üzerindeki en faydalı kanal olan kurzgesagt – ın a nutshell'ın crispr videosunu buraya biraz daha insancıl bir yöntemle açıklamaya çalışacağım.

    -----
    crispr nedir?
    -----
    crispr; bir dna arşividir. şöyle bir örnekle açıklayalım:

    bakterilerin baş düşmanı virüslerdir. he-man için iskeletor ne ise bakteriler için virüsler öyledir. virüsler bakterilerin üzerine yerleşiyor, bakterinin dış cephesini delerek içeriye kendi dna'sını bırakıyor. bu sayede bakteri hücresini ele geçirecek, ve onu kendisi gibi virüsleri üretmek için bir fabrika niyetine kullanacak. nasıl? çok fena yöntem değil mi?

    yalnız bu her zaman işe yaramıyor. nadiren bazı bakteriler bu virüs saldırılarından kurtulmayı başarabiliyorlar. evet, içlerine virüs dna'sını verdi ama bakteriyi ele geçiremedi. bakteri kardeşimiz; virüsün dna'sını alıyor ve arşivine koyuyor. bu arşivin adı crispr. hah işte bu! peki bu arşiv ne işe yarayacak?

    mesela aynı virüs bi daha saldırsın buna. bakterinin dış cephesini gene deliyor ve içeri dna'sını bırakıyor. bu bırakılma sonrasında; bakteri kardeşimiz crispr'dan yani dna arşivinin bir kopyasını çıkarıyor, daha doğrusu rna, tam olarak kopya değil, dna'nın yarısı ama diğer yarısının belirlenmesinde de yardımcı oluyor, neyse boş verin burayı.

    bu noktada adını hatırlamak zorunda olmadığınız cas9 adlı bir protein var. bu protein; arşivdeki her parçayı yeni gelen dna'ya uyarlamaya çalışıyor. tencere-çanak misali bir uyuşma gördüğü anda, virüs dna'sını kesiyor ve saldırıyı başarısız kılıyor. bu noktada cas9 adlı proteini övmeden olmaz, adam tam olarak bir dna cerrahı. yani bi tavuktan aldığın proteine bak bi de buna bak.

    sonuç olarak ne oldu? bakteri virüs saldırısını önledi.

    -----
    bizim ne işimize yarayacak?
    -----
    crispr, bütün genetik çalışmaların maliyetini ve süresini anında azaltıyor, hem de %90 oranında falan siz düşünün artık.

    bu tabi asıl mesele değil, asıl mesele şu; yukarıda bahsettiğimiz bakteri o virüse karşı artık dirençli. bir daha aynısı saldırsa bizim gibi aşı olmak için eczaneye koşmayacak. ve biz, insanoğlu olarak, bunu kullanabiliriz. mesela yeni bi virüs çıkıyor adı r1t4 falan, fena salladım ha. biz bir tane bağımsız bakteriyi alıyoruz, koyuyoruz laboratuvara, bu virüsün dna'sını veriyoruz, arkadaş bunu kendi dna arşivine koyuyor, sonra bir daha geldiği zaman virüsün işe yaramasını engelliyor. yani ilk başta olduğu gibi savaştan gazi olarak ayrılmasına gerek yok.

    asıl mevzuya hala gelmedim, şimdi geliyorum; bunu insanlar üzerinde kullanabiliriz. insan tek bir hücre olarak gelişmeye başlamıyor mu? evet. o zaman bu ilk hücreye müdahale edebiliriz. bu müdahalede hem bazı hastalıklara karşı ayakta durabiliriz hem de bazı genetik hastalıkların önüne geçebiliriz. işte genetik hastalık olayı çok önemli.

    insanoğlunun dna'sı bozuk. 3000'in üzerinde genetik hastalık, dna üzerindeki sadece bir harfin bozuk olması yüzünden var. cas9 denilen bu protein bunu düzeltebilir. mesela renk körlüğü, genetik bir hastalıktır. bu yöntem ile renk körlüğü geni tamir ediliyor ve o kişi normalde renk körü olacakken bu yöntemle bu illetten kurtuluyor.

    dna'mız üzerinde yaşayan virüs genleri de var bu arada. mesela uçuk ! uçuk bir virüstür ve bizim dna'mızda vardır. bu ne demek? şu anda vücudundaki her hücrenin içinde bu virüs var. resmen ete kemiğe bürünmüş bir virüs bu. bu yöntemle binlerce yıldır dna'mızda bulunan bu virüsten kurtulabiliriz! kızlar bir daha uçukla uğraşmayacaklar, şimdikiler uğraşacak da sonrakiler uğraşmayacak.

    işin özeti, insan dna'sı kusurlu, bayaa kusurlu, ama bunu düzeltebiliriz ve ortaya bizden daha sağlam insanlar ortaya çıkarabiliriz. yalnız burada 2 tane püf nokta var.

    1-) tedavi tek insana has. mesela birisinin renk körlüğünü düzelttin, tamam, tedavi onla birlikte ölecek. ama eğer iki kişide aynı tedaviyi uygularsan ve bu iki kişiden bir nesil meydana gelirse, işte bu nesil renk körlüğü genini taşımayacak demektir. bu yöntemi yüzlerce insanın tek hücre olduğu zamanda uygularsanız, ve bu yüzlerce insan kendi aralarında çocuk sahibi olurlarsa, elinizde tertemiz bir üstün insan nesli elde edebilirsiniz.

    2-) tedavi insan tek hücre iken uygulanabilir. mesela şu anda sana niye bunu yapamayız? çünkü o zaman vücudundaki her hücreyi tek tek alıp bu yöntemle tamir etmek lazım, e olmuyor tabii. ama tek hücre iken? işte o zaman vücudun bütün hücreleri o ilk tamir edilen hücreyi referans alarak çoğalacakları için tek hücrede ancak mümkün olabiliyor. zaten bu yöntem ile insan dna'sındaki genetik hastalıkların önüne geçmeye çalışıyorlar, malesef aspirin değil ki alamıyoruz.

    -----
    insan üzerinde neler yapabiliriz?
    -----
    yukarıda bahsettiğim gibi, bazı genetik olarak üzerimizde taşınan hastalıkları gelecek nesillere aktarmayı durdurabiliriz. mesela çocuğun olacak, diyorsun ki bu çocuk mesela albino olmasın, şeker hastalığı falan olmasın, bu arada şuna güzel bir metabolizma verin falan diyebilirsin. hatta boyunun uzun olmasını, göz kusurlarından kurtulmasını, hatta daha zeki olmasını da sağlayabilirsiniz! resmen sims'te insan yapar gibi çocuk sahibi olacaksın lan daha ne istiyorsun?

    -----
    ölümsüz olabilir miyiz?
    -----
    şimdi bu yöntemle kısmen mümkün ama burada ölümsüzlük tanımını değiştirmek gerekiyor. mesela superman, adamın üzerine vinç düşse hayatta kalır, ama bizim üstümüze düşse ölürüz. bu yöntemle belki daha fiziksel olarak dayanıklı insanlar elde edebiliriz ama mesela kafamıza 500 km/s hızla gelen bir mermi bizi öldürür. o yüzden bizi öldüren sadece bazı etkenleri ortadan kaldırabiliriz. dediğim gibi ölümün %100 önüne geçemeyiz ama bizi öldüren çoğu şeyden kurtulabiliriz.

    -----
    yaşlanmayı bitirebiliriz
    -----
    bugün insanların %66'sı (2/3'ü falan) yaşlılığın getirdiği nedenlerden dolayı ölüyor. yani bizi öldüren yaşlılık değil, yaşlılın oraya çıkardığı sorunlar. mesela yaşlandıkça karaciğerin çalışması aksıyor varsayalım, yaşlandıkça en sonunda karaciğer iflası oluyor ve ölüm gerçekleşiyor. e yaşlanmasaydık bu olmayacaktı o zaman? bizim direkman yaşlanmamıza sebep olan genler var. bunlar dna'mızın içinde. yukarıda bahsettiğim üstün insanların genlerine bu yöntemle müdahale edip yaşlanmalarının önüne geçebiliriz.

    yaşlanmama olayı şu anda ıstakozlarda, planaryalarda ve turritopsis dohrnii denilen değişik bir deniz anası türünde mevcut. istersek bunların bile genlerini kendimize alabiliriz.

    -----
    elimizde nasıl patlar?
    -----
    üstün insanlardan oluşan bir ordudan korkuyorsanız; http://wh40k.lexicanum.com/wiki/space_marines

    üstün insanların oluşturacağı yeni standartlar normal insanları zora sokmaz mı?

    sokar, ama bu bir geçiş sürecidir. burada asıl amaç ne? insanoğlunun genlerindeki sorunları ortadan kaldırmak, sonunda bütün dünyadan o hastalığı silmez, mesela gelecekte uçuk hastalığının olmasını istemiyorsanız bütün insanlardan bunu silmez zorundasınızdır. bu yüzlerce yıl sürebilir, yeni bir dünya düzeni kurabilir, ama zaten amaç bu değil mi? yeni bir dünya?
  • bugun yaptigim sey.

    bu basmakalip giris uzerine, "vallahi yaptim lan" diye devam etmek istiyorum. bir genin orijinal lokusuna tag knock-in yaptim fare kok hucrelerinde ve tag'le immunoprecipitation'im calisti bugun. eger metodla ilgili sorulariniz olursa bana sorabilirsiniz ama ben de suradaki protokolden yola ciktim; doi:10.1038/nprot.2013.143

    baslarda biraz ugrastirdi; ama sonra sorunumu cozdum. puromycin selection'a transfection'in 48'inci saatinde baslayin, o zaman daha cok koloni elde edersiniz.
  • denek arayan yeşillendirsin dediğim icat. fare mare bekleyemem olmuş bu.
  • ölümcül bir genetik hastalık olan krabbe hastalığı için bir çare olabilir mi bu, büyük bir heyecan ve merak içerisindeyim? 10 aylık kızım krabbe ile mücadele ediyor. 1 ay önce ilik nakli oldu, durumu kritik. bilen kardeşler yeşillendirin.

    hadi hadi güzel bi şey söyleyin!

    edit: kızım öldü.

    umarım bu hastalığın tedavisi bir gün bulunur ama ben duymam :(
  • istediginiz hucrenin icerisindeki dna yi kafaniza gore hoplatip ziplatmanizi saglayan yontem. yani kabaca orada bir ansiklopedi ve sizin elinizdede daksil ve dolma kalem var. ha su an itibari ile biraz eliniz tiriyor daksili saga sola bulastiriyorsunuz ya da kalemle istemediginiz yerlere birseyler yaziyorsunuz, ama bu hatalar cok ender oluyor.

    eger ne yazmaniz gerektigini biliyorsaniz, bu teknoloji ile hulk da basarsiniz einstein de.

    http://infoproc.blogspot.com/…etic-engineering.html
    http://www.technologyreview.com/…51/genome-surgery/
  • (bkz: nobel)

    (at fav'a bekle)

    not: ne bekleyecen lan 5-10 sene insan fav'mı bekler?

    6 sene sonra edit: öngörüm gerçekleşti. kendisini 6 sene önce oxford'da doktora öğrencisi iken dinlemistim.
  • moleküler biyoloji/genetik mühendisliği çalışmalarında genom düzenlenmesini kolaylaştıracak süper ötesi teknik. nasıl pcr tekniği dönemine göre bu alanlarda yeni bir devir açmış ise crisprda aynı işleve sahip olacak. aşağıda crisprın mucidi jennifer doudna'nın yaptığı ted konuşması yer alıyor hemde türkçe altyazılı. umarım doudna bu teknik sayesinde nobel alır. ama yeni gelişen her teknolojide olduğu gibi bu teknolojide olduğu gibi patent savaşları çoktan başladı bile.

    link
  • az önce crispr-cas9'nı ilk defa duyan bir biyoloji proseförüyle tanıştım. sadece muhabbet arasında konudan bahsediliyordu ve adam öyle bir hadi yaaaaaaaaaaaaaaa dedi ki o an kafamı sürtecek duvar aradım. utanmasa vallahi de benim aklıma gelmişti diyecekti ki herkes evet hocam diye suratına bakınca sustu.
    üstüne birkaç hoca, hocam biz bunları çocuklara yeterlik sınavında genel kültür alanında soruyoruz diye iyice gömünce evet evet ben de konuyu takipteyim dedi *

    burada birçok arkadaş yapılan son güncel çalışmalardan bahsetmiş ben de türkiye'deki crispr-cas9 ile ilgili son durumdan bahsetmiş oldum. içeriden bildiriyorum, durum içler acısı.

    sabır ya mendel yetiş ya miescher.
  • bazı uçuk yazıları gördükten sonra bu yazıyı yazmaya karar verdim, biraz teknik yazacağım. tabi bu sistem genom üzerinde değişiklik yapılması için kullanılan ilk sistem değil ancak talen vs sistemlere nazaran çok daha kolay, bu kolaylık da bu kadar ses getirmesine sebep oldu.

    sistem kabaca iki plazmit (tek plazmitte modifiye hallleride var) ile işliyor. ilk plazmit genelde cmv promotörü ile anlatım yapan ve crispr-cas9 plazmiti ve ikinci plazmitte genelde u6 promotörü ile anlatım yapan guide rna plazmiti. iki plazmit hücreye transfeksiyonla aktarıldıktan sonra guide rna genomda komplementer olduğu bölgeye bağlanır, cas9 proteinide guide rnaya bağlanır ve bağlanma yerinde dnayı iki zincirden de keser.

    sistemin yaptığı bütün olay buraya kadar ki kısım aslında. genomda bir kesik oluşmuştur ve bu kesiğin hücrenin tamir mekanizmaları ile tamiri yapılır. kabaca iki ana tamir yolu olur, ya hücre homolog kromozoma gidip homolog rekombinasyon ile kırığı tamir eder ya da kabaca iki ucu bir araya getirerek tamir eder. eğer siz sisteme 3. bir plazmit eklerseniz ve bu plazmitte bölgeye homoloji gösterirse hücre sizin aktardığınız dna yı homolog rekombinasyonda kalıp olarak kullanıp istediğiniz değişikliği yapabilir.

    buraya kadar herşey çok güzel ancak pratiğe gelice kazın ayağı öyle değil. öncelikle hücrelerin büyük çoğunluğu kabaca iki ucu bir araya getirerek hasarı tamir ediyor yani aktardığınız 3. plazmitin yüzüne bile bakmıyor. ancak crispr sadece bir kesik atmıyor aynı zamanda nükleotitte siliyor. bu sebeple crispr en fazla knock out için kullanılıyor. eğer bir ya da 2 nükleotit silerse çerçeve kayması gerekleşiyor ve gen yok olmuş oluyor eğer 3 ve katları oranında silerse bir aminoasit yok oluyor ve bu durumda genelde bir bok olmuyor çünkü proteinin neredeyse tamamı çalışır halde kalıyor. sistemin kaç tane nükleotit sileceği belirsiz, yada homolog kromozomlara nasıl etki edeceğide belirsiz. iki alele farklı etki ettiğine şahit oldum. ve aynı şekilde 15 nükleotit sildiğine de şahit oldum.

    hücre kültüründe işler nispeten kolay, plazmitleri transfekte ediyorsunu marker gen ile seiyorsunuz. %90 oranında puromisin kullanılır, transfekte olanlar yaşar diğerleri ölür. çalıştığınız hücre biraz illet ise buralarda baş ağrısı çekersiniz ama fazla uğraştırmaz. tabi bu transfekte olanların işinize yarayacağı anlamına gelmiyor o yüzden tek hücre seçimine gidip hücre hattı oluşturursunuz ve her hattı teker teker kontrol edersiniz. benim bu labdaki arkadaşın çalışmasında 30 tane hat kontrol ettik sadece 1 tanesi işe yarardı mesela. benim çalışmamda 3 tane farklı geni aynı anda knock out yapmaya çalıştım sinir krizleri geçirdim.

    bir diğer nokta guide rna aslında büyük bir dizi ama sizi ilgilendiren sadece 20 nükleotitlik kısmı. bu 20 nükleotitlik kısmı siz tasarlıyorsunuz ve genomda hedefi belirleyen yer burası. bu 20 nükleotitin hemen bitiminde ngg dizisi olması gerekiyor yani bir tane her hangi bir nükleotit ve iki tane guanin buna pam dizisi deniyor. genomda bunlardan tabi çok var ancak hedeflediğiniz genin içindeki pam dizileri sizi burada kısıtlayan bir faktör oluyor, gibip c terminalde değişiklik yapmak saçmalık. ve o 20 nükleotitlik kısımın çok spesifik olması gerekiyor. istediğiniz geni knock out yaparken 20 ayrı gene daha aynısını yapmak istemezsiniz.

    buraya kadar ki kısım hücre kültürü için idi. eğer siz bu yöntem ile bir hastalık tedavi etmek isterseniz işler karışıyor. burada araya giren etmenler crispr sisteminden kaynaklanmıyor hücrelerin kendilerinden kaynaklanıyor. hücre kültüründe işler genel olarak kolay sayılır hücreler nispeten kolayca transfekte ediliyorlar fakat normal hücreler sitoplazmalarında dna tespit ettikleri zaman apoptoza gidiyorlar bu durumda primer hücreleri neredeyse transfekte edilemez hale getiriyor. tabi bu ilk sorun değil. ilk sorun bu sistemi hücreye ulaştırmak. laboratuvarda herşey elimizin ucunda hücrelerin üzerine plazmitleri ve transfeksiyon reagentleri boca ediyoruz ama canlı bir varlığa bunu yapma şansımız yok. aynı şekilde bir insanda hade transfekte olmayan hücreleri öldürelim deyip deyip promisin verme şansınız da yok.

    yinede bazı hücrelere ulaşma şansımız var. viral vektörler bu konuda epeyce etkili olabiliyorlar ancak crispr sistemini tedavi amacıyla viral vektör üzerine kurmak çok kolay sayılmaz. şimdi bizim labda hiv üzerine kurulmuş olanı var ama bu sistem genoma entegre ediyor, şahsen ben bu şekilde tedaviyi pek makul göremiyorum ömrünüz boyunca cas9 ve grnayı eksprese etmeniz riskli durup dururken alakasız bir geni kapatabilir. ben sistemi influenza virüsü üzerinde kurmak istemiştim ama danışmanım influenza cas9'u kaldırmaz deyip hevesimi kursağımda bırakmıştı.

    tabi ex vivo gen tedavisi ile kullanılabilir ve gerçekten etkilide olur ancak oda sadece kan hücreleri ile alakalı hastalıklarda kullanılabiliyor.

    bir düzen içinde yazmaya çalıştım ama konunun bir noktasından diğerine çok atladım bir ara editleyip düzeltirim belki.
hesabın var mı? giriş yap