pcr

• bir de real time pcr denen bir cesidi vardir ki bir dongusu yaklasik 3 dolara malolur, onlarca dongu ve yuzlerce ornekle calisildiginda caniniza okur, projede butce kalmaz, hayaller kul olur.
  
  (bkz: doktora ogrencisiyken simitci olmak)
• pcr, önceden belirlenmiş bir nükleik asit bölgesinin milyonlarca kopyasını yapmaya yarayan bir enzimatik metottur. aslında pcr işlemi canlı hücrelerde devamlı olmaktadır. canlı hücreler içindeki polimerizasyon işlemi, pcr tüpleri içinde, gerekli materyaller konularak ve sıcaklık parametreleri uygulanarak taklit edilmektedir. pcr işleminin özgüllüğü çok yüksek düzeye ulaşmış, uygun koşullar sağlandığında tek bir genomu dahi saptayabilecek hale gelmiştir.
  
  pcr işleminin esası, saptanması hedeflenen canlıya ait nükleik asidin özgül kısmının seçilip bu kısmı tanıyacak primer adı verilen sentetik oligonükletidlerin hazırlanarak bu oligonükleotidlerin hedef genom üzerine bağlanması ve arada kalan bölgenin enzimatik yolla çoğaltılmasıdır.
  
  pcr işlemleri bilgisayar kontrollü termal döngü cihazlarında gerçekleştirilir. bu termal döngü cihazlarında gerçekleştirilen pcr reaksiyonunda iki sentetik oligonükleotid, kalıp dna, ısıya dayanıklı dna polimeraz ve dört tür dntp (datp, dttp, dgtp, dctp) ’ ler yer alır.
  
  kalıp dna denatürasyon sıcaklığına çıkartılıp zincirlerinin birbirlerinden ayrılmasını takiben soğutulduğunda primerler tek zincirli kalıp dna üzerinde bulunan hedef bölgelere bağlanırlar. bunu takiben primerler dna polimeraz tarafından dna sentezi gerçekleştirilmesi ile uzarlar. bu üç basamaklı döngü 30-40 defa tekrarlandığında çoğaltılması amaçlanan dizinin 1.000.000’ dan fazla kopyası elde edilmiş olur.
  
  pcr işlemlerinde dna’ nın sentezlenmesi amacıyla kullanılan dna polimeraz enzimi sıcak su kaynaklarında yaşayan termofilik bir bakteri olan thermus aquaticus’ dan izole edilmiş olan taq dna polimerazdır. taq dna polimeraz denatürasyon sıcaklığı olan 94-95°c’ de aktivitesini kaybetmeden görev yapabilmekte ve bu da her döngüde pcr reaksiyonuna yeniden enzim eklenmesini engellemektedir.
  
  pcr prensibi tekrarlanan üç basamağa dayanır.
  
  a. denatürasyon: bu basamakta pcr reaksiyonu içinde yer alan çift zincirli kalıp dna’nın birbirinden ayrılması sağlanır. genelde 94-95°c’de 1 dakika denatürasyon için yeterli bir süredir.
  
  b. primerlerin bağlanması: denatürasyon işlemini takiben sıcaklık 50-60°c’ ye düşürüldüğünde primerler tek zincirli kalıp dna üzerindeki hedef bölgelere bağlanırlar. primerlerin bağlanması için 30 saniye yeterli bir süredir.
  
  c. zincir uzaması-polimerizasyon: bu basamakta primerlerin taq dna polimeraz enzimi vasıtasıyla dna zincirini tamamlamaları gerçekleşir. zincir uzaması taq polimerazın aktivitesinin en yüksek olduğu 70-75°c arasında 1.5 dakika sürede gerçekleştirilir.
• en olmadik yerlerde sorun cikartma potansiyelinden dolayi, surekli yapan insanlarin "oo pcr, cagimizin boyyuk icatlarindan aferin mullis aferin" gibisinden cumleler sarfedilmesine gicik oldugu teknik. zira bazen oyle bir noktaya gelinir ki pcr ya cikmayacak, ya da cikmayacaktir. buna birtakim ornekler verilebilir.
  a) negatif kontrolun pozitif cikmasi: negatif kontrolde pozitif sonuc cikmamalidir, zira bu tupte dna falan olmadigindan amplifikasyon da olmayacaktir. zavalli arastirmacimizin alnina bir kontaminasyon damgasi basariz.
  b)optimizasyonlar: pcr ile ilgili manuellere bakildiginda o kadar cok optimizasyon gorulebilir ki insan "oha hayvan herifler bunu da mi optimize ettiniz" diyebilir. dememelidir, bunu da optimize etmek diye bir sey yoktur, zaten pcr kontaminasyondan dolayi her bokta sorun cikarmaya meyillidir, bir de araya optimizasyon yamukluklari girmemelidir. olmasi durumunda bir gradient pcr cekerekten her tupe dereceli isitma ile optimum sicaklik belirlenmesi yapabilir. eger sorun bunda degilse, cogalmayi gerceklestiren taq polimeraz enzimi icin gerekli olan magnezyum klorur miktari standardize edilebilir...gider bu. genellikle izlenmesi gereken uzuun bir sira lab manuellerindeki protokollerde yazacaktir.
  
  pcr da boyle gaflet ve dalalet gerektiren bir olaydir, kivir ziviri coktur. ugrasamayan arastirmacilarin eppendorf tupleriyle tc polis yazilir.
• oyunumsu bir sekilde ögrenmek icin:
  http://nobelprize.org/…hemistry/pcr/game/index.html
• ks. polymerase chain reaction
  (bkz: polymerase chain reaction)
• genetik biliminin belkide en önemli toolu haline gelmiş bir cihazdır.var olan bir dna dan,milyonlarca üretmenizi ve istediğiniz kadar klone üretmenizi sağlar.babalık testi gibi testlerde,tanınmıycak haldeki cesetlerin kimlik tayininde vs vs vs kullanılır.
• bu metodun patenti f.hoffmann-la roche'da bulunmakta. amerika'da patenleri bu sene bitti. avrupa'da da mart 2006'da bitiyor.
• yıllar sonra karanlık müzelerde sergileneceğini düşündüğüm unutmayacağım teknoloji...
• pek çok çeşidi olan (asymmetric pcr, nested pcr, rt-pcr, multiplex pcr) bu tekniğin en tercih edileni real-time pcrdır.
  'bu teknik cetus firmasının insan genetiği departmanında çalışan araştırmacı kary mullis tarafından 1985’ te bulunmuş ve patenti alınmıştır. pcr; ilk defa, aynı yıl r. saiki, k. mullis ve arkadaşları tarafından orak hücre anemisinin tanısının konulmasında uygulamaya sokulmuştur. 1993 yılında bu çalışma kary mullis’ e nobel ödülünü kazandırmıştır.
  
  pcr, herhangi bir organizmaya ait genomik dna’ daki özgül bölgelerin çoğaltılmasını ( amplifikasyonunu ) sağlayan basit ama çok başarılı bir in vitro dna sentezi yöntemidir. pcr; dna molekülünün milyonlarca hatta milyarlarca kopyasını kısa zamanda yapan bir tekniktir. pcr;
  
  1) dna’ nın dizi analizi ve dna haritalamasında
  2) genetik hastalık teşhisinde ( orak hücre anemisi, kistik fibrozis, fragile x sendromu, aids, lösemi v.b. )
  3) dna parmak analizinde
  4) insan evrimi araştırmalarında
  5) insan genom projesi’ ndeki araştırmalarda
  6) allellik dizi varyasyonlarının gösterilebilmesi ile doku transplantasyonu için doku tipinin belirlenmesinde
  7) adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesi ( analık babalık tayini )
  8) tarımda ( tohum saflığının belirlenmesi )
  9) sistematik ve evolüsyon çalışmalarında ( doğadaki çeşitli canlı türlerinin tanısı, türler arasındaki polimorfizmin belirlenmesinde )
  10) hatta mısır’ daki mumyalardan dna klonlamasında da kullanılmaktadır. (kaynak)
  
  makalesini okumak isteyen ilgili arkadaşlar için: [http://http/http://www.labtrade.com.br/…ds/2012/04/mullis86.pdf http://www.labtrade.com.br/…ds/2012/04/mullis86.pdf]
  
  kolay gelsin. kontaminasyonsuz, troubleshooting görmediğiniz döngüler dilerim.
• dna'nın belirli bir segmentinin çoklu kopyalarını yapmak için moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. metot basitçe tüp içerisinde dna'nın uygun koşullarda çoğaltılması esasına dayanır. bu metot ile kısa süre içerisinde çok küçük miktarda dna baz dizisinden milyonlarca dna parçacığı çoğaltmak mümkündür.
  
  bir çeşit "in vitro klonlama" olarak da tanımlanan pcr; 94 °c-98 °c aralığında gerçekleştirilen denaturation, 37 °c-65 °c aralığında gerçekleştirilen annealing ve 72 °c’de gerçekleştirilen elongation aşamalarından oluşur ve bu döngülerin belirli sayıda tekrarlanarak dna'nın üssel olarak katlanmasına dayanır.
  
  pcr yaygın olarak kalıtsal hastalıkların teşhisi, genetik parmak izlerinin tanımlanması, bulaşıcı hastalıkların teşhisi, genlerin klonlanması, babalık testi ve dna hesaplaması gibi çeşitli konularda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. ayrıca pcr'a dayalı rapd, aflp, ssr ve ıssr gibi markör teknikleri geliştirilmiştir. bu teknikler birçok bitki ve hayvanda tür içi ve türler arası genetik akrabalığın teşhisinde kullanılmaktadır.
  
  (bkz: polymerase chain reaction)